β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-GD)試劑盒說明書
點擊次數(shù):1088 日期:2018/6/27 16:43:59
β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-GD)試劑盒說明書
分光光度法 50 管/48 樣
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義
β-GD 廣泛存在于動物組織中,是一種參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程的基質(zhì)降解酶,具有水解固
醇葡萄糖醛酸和酸性粘多糖等生理功能。該酶在肝細(xì)胞中含量較高。此外在胃癌組織中含量
豐富,測定胃液β-GD 活性對于研究胃癌具有重要的意義。
測定原理
β-GD 催化苯酚 β-D-葡萄糖醛酸產(chǎn)生游離的酚酞,通過測定苯酚含量反應(yīng)該酶活性高低。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。
試劑的組成和配制
提取液:液體60mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體5mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前加入5mL 蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑仍
-20℃保存;
試劑三:液體37.5mL×1 瓶,4℃保存;
試劑四:1μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液10mL,4℃保存;
樣品測定的前處理
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.1g 組織,加入1mL
提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟
1、分光光度計預(yù)熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長至540nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定(在EP 管中加入下列試劑)
試劑名稱(μL) 加樣孔
測定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管
試劑一 100 100 100
試劑二 100 100 100
樣本 50
1μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液 50
蒸餾水 50
混勻后,37℃水浴30min
試劑三 750 750 750
混勻, 540nm 下測定各管吸光值
注意:標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測一次。
β-GD活性計算
(1)按樣本鮮重計算:
單位定義:每小時每g 鮮重樣品中催化產(chǎn)生 1μmol 酚酞的量為一個活力單位。
β-GD(μmol/h/g 鮮重)= (C 標(biāo)準(zhǔn)管×V1)×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
÷(W×V1÷V2)÷T=2×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每小時每mg 組織蛋白催化產(chǎn)生 1μmol 酚酞的量為一個活力單位。
β-GD(μmol/h /mg prot)= (C 標(biāo)準(zhǔn)管×V1)×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
÷(V1×Cpr)÷T=2×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr
C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度, 1μmol/mL;V1:加入樣本體積:0.05mL;V2:加入提取液體積,
1mL;T:反應(yīng)時間,0.5h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。